猪蓝耳病毒(PorcineReproductieandRespiratoUSyndromeVirus，PRRSV)最显著的生物学特性是对(PAM)的亲嗜性，首要攻击具有重要免疫作用的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，在病猪的肺脏病毒滴度可达105TCID50/ｇ，占肺脏受感染细胞的80%～94%，导致猪肺部病变，肺气体交换受到严重影响，并产生大量痰液堵塞支气管，造成机体全身缺氧，猪身体因缺氧而发困，嗜睡，全身酸痛（和人患重流感类似）。岳阳市信德科技投资顾问中心猪高热病防治研究所与湖南广大畜牧兽医研发有限公司共同研制的中药复方蓝耳康，含有大量水溶性特种抗病毒蛋白、杀灭病毒的生物多酚、生物多酮和萜类成份，对猪蓝耳病有很好的临床效果，但对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导的猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡是否具有保护作用，未见文献报道。本实验用细胞培养方法，观察蓝耳康对猪蓝耳病毒PRRSV诱导的巨噬细胞PAM凋亡时的细胞存活率、DNA和凋亡率的变化，探讨蓝耳康对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡的保护作用。

1　材料与方法

1.1　药物及试剂

药物的制备：取蓝耳康100g，按常规煎煮，过滤，浓缩，制成100％浓度的药液。

试剂：MTT用PBS配成5g/L。碘化丙啶、RNaseA、蛋白酶K购自Sigma公司。FCS、DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司。TX.114购自Anlresco公司。苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇等为国产分析纯。

1.2　PRRSV病毒增殖与纯化

猪蓝耳病毒株（PRRSV）来自中监所；MARC-145细胞长成单层后，将PRRSV病毒接种于长满单层的MARC-145细胞,37℃吸附1h。加入含2%FCS的DMEM营养液37℃培养2~3天，细胞病变（CPE）达70%时，收获病毒细胞。反复冻融3次，2000r/min离心30min（4℃）。取上清液于90，000×g离心2h（4℃）。弃上清，加入1/100原体积PBS，4℃悬浮过夜；取出经30%~60%蔗糖密度梯度，120，000×g离心3h，收获病毒带于-20℃保存备用。

1.3　细胞培养

猪肺泡巨噬细胞系PAM购自中国农业大学细胞生物学研究中心细胞库。用含体积分数为10％胎牛血清、100μg／mL青霉素和100μg／mL链霉素的RPMI一1640完全培养基，37℃、5％CO2条件下培养。细胞呈单层生长铺满培养瓶后用0.25％的胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期细胞做实验。

1.4　实验分组

待细胞生长至80％时，换新培养基将细胞分为三组：对照组(不含PRRSV的完全培养基)；PRRSV处理组(完全培养基+PRRSV)；蓝耳康处理组(完全培养基+蓝耳康)；预处理1小时后加PRRSV处理24小时(完全培养基十蓝耳康+PRRSV)。

1.5　MTT法检测细胞活力

取对数生长期细胞．以2＊104／孔接种于96孔培养板，200μL／孔。在37℃、5％CO2条件下培养过夜后，按分组要求给以不同处理因素，每组设4个平行孔。培养24h后，每孔加5g／LMTT20μL，再培养4h，倾去培养液，加DMSO150μL／孔，待紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570nm处读取吸光度(OD)。取4孔OD值的均数按公式计算细胞存活率。

细胞存活率()=实验组OD／对照组OD*100％。重复3次。

1.6　细胞DNA片段化分析

收集细胞，用冰冷的PBS洗2次，胰酶消化，培养基(含血清)中和，离心收集细胞(800rpm，5min)，再用PBS洗两次。加入500LDNA消化缓冲液，室温放置10min，再加2μL20mg／mL的RNaseA，37℃，lh；再加入5μL20mg／mL的蛋白酶K，55℃，lh；离心后加入等体积抽提液(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，9000rpm离心15min；取上清至另一EP管，加入1／10体积3mol／L的乙酸钠，再加入2.5倍体积100％乙醇一20℃沉淀过夜；12000rpm离心10min；30LTE溶解DNA。每样品取8μLDNA于1.8％琼脂糖凝胶电泳。

1.7　碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡

药物处理24h后，用质量浓度为2.5g/l胰蛋白酶消化贴壁的PAM细胞，1000rpm离心10min，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加人体积分数为0.70的冰乙醇固定。1000rpm离心10min，去上清，PBS漂洗2次，调整细胞浓度为1＊106／L。加50μLRNaseA(质量终浓度为lg)，37℃水浴30min。加PI至质量终浓度为50mg／L，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4℃避光染色30min后，上流式细胞仪检测(激发波长：488nm；发射波长：610nm)各期细胞DNA的含量。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA直方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少。

2　结果

2.1　PRRSV的细胞毒性作用

为了解猪蓝耳病毒(PRRSV)对猪肺泡巨噬细胞PAM活性的影响，分别用0.5、1.0、3.0、6.0、10、20mg/LPRRSV孵育猪肺泡巨噬细胞PAM24小时后，MTT法观察细胞生长的变化。结果显示：随着药物浓度的增加，PRRSV抑制细胞生长的能力增强，存活率依次为90.50％±1.50％、85，00％±3.20％、61.66％±1.20％、48.45％±3.40％、19.85％±3.70％、12.60％±0.50％(n=12)。PRRSV在3.0mg/l时就对细胞活性产生明显的抑制作用(P<0，01)，其IC50大约为6.0mg/l。

2.2　不同浓度的蓝耳康对猪蓝耳病毒(PRRSV)抑制猪肺泡巨噬细胞PAM生长的影响

用100、200、300、400μmol/L蓝耳康预处理细胞1h后，6.0mg/L猪生殖和呼吸系统综合征病毒(PRRSV)孵育24h，MTT法观察细胞生长的变化情况。结果发现100-500μmol/L的“蓝耳康”均可使6.0mg/L猪蓝耳病毒(PRRSV)抑制猪肺泡巨噬细胞PAM生长的作用下降(P<0.05或0.01)，其中300μmol/L的蓝耳康作用效果最好。

2.3　蓝耳康对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡DNA的影响

细胞凋亡时细胞内的核酸内切酶切割核小体，可形成180-200bp或成倍数的几个核小体长短的DNA片段。DNA片段化分析发现经猪蓝耳病毒(PRRSV)孵育24h可出现凋亡细胞特征性的梯状条带，而300μmol/L蓝耳康预处理1小时后，未见凋亡特征性的梯状条带。

2.4　蓝耳康对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡的影响

采用PI染色FCM检测细胞凋亡以观察蓝耳康对谷氨酸诱导猪肺泡巨噬细胞RAW凋亡的影响。正常细胞组凋亡率为2.84％；蓝耳康单独处理组凋亡率为3.6％；6.0mg/L猪蓝耳病毒(PRRSV)作用24小时后，猪肺泡巨噬细胞PAM的凋亡率为48.43%；用300μmol/L蓝耳康预处理1h，再加6.0mg/L猪蓝耳病毒(PRRSV)作用24小时后，猪肺泡巨噬细胞PAM的凋亡率下降至6.0％。

3　讨论

3.1　猪蓝耳病毒与巨噬细胞凋亡

猪蓝耳病毒能引起呼吸道感染、生殖系统感染等；本实验证实了猪生殖和呼吸系统综合征病毒(PRRSV)可呈浓度依赖性降低巨噬细胞PAM的存活率，并且通过流式细胞仪测定细胞凋亡率和典型的凋亡“梯带”从DNA水平证实了猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导巨噬细胞PAM凋亡的作用。本实验利用猪蓝耳病毒PRRSV诱导巨噬细胞PAM损伤模型，体外更好模拟猪蓝耳病毒(PRRSV)病理过程，用以观察到蓝耳康抗猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导的猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡作用。

3.2　蓝耳康与细胞凋亡

蓝耳康是天然植物中提取的多种生物活性成份，有极强的抗氧自由基、抗炎和拮抗细胞内钙超负荷作用，因为细胞凋亡与氧自由基、炎性细胞因子(如IL一1p、IL一6、TNF-α、TNF-β等)和细胞内钙超负荷关系也极为密切，蓝耳康的这些作用无疑有助于抗凋亡。300μmol/L蓝耳康可明显提高经猪蓝耳病毒(PRRSV)作用24h后猪肺泡巨噬细胞PAM的存活率，并对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导猪肺泡巨噬细胞PAM所发生的凋亡具有良好的保护作用，降低DNA的降解和细胞凋亡率，说明蓝耳康可能具有对抗多种致凋亡诱发因素的作用。

3.3　蓝耳康与猪蓝耳病毒(PRRSV)感染

蓝耳康同时具有抗猪蓝耳病毒(PRRSV)、抗菌、抗病毒等活性，猪蓝耳病毒(PRRSV)感染往往同时并存细菌、病毒的感染，蓝耳康本身既能抗凋亡，又能针对诱导凋亡的因素发挥作用，同时又能针对感染的多个致病因素发挥作用。蓝耳康可以从多层次，多角度治疗PRRSV疾病及其一系列的并发症，提高疾病的满意终点和远期疗效。

4　结论

4.1　蓝耳康有独特的抑杀PRRSV病毒的方式

PRRSV病毒的结构：呈球形，直径约为48～83nm，核衣壳直径约为25～30nm，外绕脂质双层膜。“蓝耳康”（暂定名）含有大量的生物酚、生物酮、多萜类等生物活性成份，与脂质有良好的亲合性，很容易溶解PRRSV病毒的脂质囊膜、增加囊膜的通透性，使囊膜内的成分渗出，病毒失去需要的生态环境而死亡，达到抑杀PRRSV病毒的作用。

4.2　蓝耳康能保护猪肺泡巨噬细胞(PAM)

PRRSV病毒最显著的生物学特性是对猪肺泡巨噬细胞(PAM)的亲嗜性，首要攻击具有重要免疫作用的PAM，导致免疫力丧失，产生免疫抑制，引发混合感染（猪蓝耳、猪瘟、伪狂犬、圆环病毒、链球菌、附红细胞体），并急性传染（已席卷了整个中国），造成大批猪只死亡。蓝耳康含有大量特种活性蛋白，该蛋白能够非特异性地与猪肺泡巨噬细胞(PAM)的核糖体结合，从而可以有效地阻断病毒基因组RNA与猪肺泡巨噬细胞(PAM)核糖体结合，阻断病毒基因复制和病毒蛋白质合成，有效地保护了猪肺泡巨噬细胞(PAM)。

4.3　蓝耳康安全

蓝耳康的直接来源于天然植物，其干叶和花枝以及挥发油已成为北美和欧洲最重要的食品调味品和防腐剂，并且已成为香皂、洗涤剂、香水和膏霜类配方中的添加剂，均没发现不良反应。蓝耳康的低毒性也为临床解决了使用抗生素所带来的众多副作用的难题。